例：枳实导滞丸中黄芩苷的含量测定实验—薄层色谱法(通则0502)

实验材料：枳实导滞丸，索氏超声波提取器

【处方】枳实（炒）100g  大黄200g  黄连（姜汁炙）60g  黄芩60g  六神曲（炒）100g  白术（炒）100g  茯苓60g  泽泻40g

【制法】将以上八味粉碎成细粉，过筛，混匀，用水泛丸，干燥。

【含量测定】取本品适量研细，取约0.5g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇90ml，加热回流4h，趁热滤过至100ml量瓶中,用少量甲醇洗涤容器，洗液与滤液合并，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取5ml，置25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含50ug的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，精密吸取供试品溶液5ul、对照品溶液2ul与5ul，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲醇为展开剂，展开，展距约3cm，取出，晾干，喷以1%三氯化铝的甲醇溶液，放置3h,在紫外线灯（365nm)下定位，照薄层色谱法（通则0502，薄层色谱扫描法）进行荧光扫描。激发波长λ=300nm，线性扫描，然后测量供试品荧光强度的积分值与对照品荧光强度的积分值，计算，即得。

3.1.3.黄芩制剂总黄酮测定

   黄芩（购于西安同仁堂大药房），芦丁（分析纯，上海试剂药品厂），亚硝酸钠（分析纯，成都市科龙化工试剂厂），硝酸铝（分析纯，成都市科龙化工试剂厂），氢氧化钠（分析纯，成都市科龙化工试剂厂），邻苯三酚（分析纯，成都市科龙化工试剂厂），盐酸（分析纯，天津市天力化学试剂有限公司），双氧水（天津市天力化学试剂有限公司），硫酸亚铁（分析纯，成都市科龙化工试剂厂），水杨酸（分析纯，天津市天力化学试剂有限公司），无水乙醇（分析纯，天津市天力化学试剂有限公司），三羟基甲基氨基甲烷（分析纯，天津市福晨化学试剂厂），邻二氮菲（分析纯，天津市福晨化学试剂厂），DPPH（购于阿拉丁试剂）。

1. 仪器

    高速粉碎机（FW80型，北京中兴伟业仪器有限公司）；紫外可见分光光度计（722N，上海精密科学仪器有限公司）;电子天平（YP202W，上海精密科学仪器有限公司）；循环水式多用真空泵（SHB-Ⅲ，郑州长城科工贸有限公司）；超声波清洗机（11—1404，宁波新芝生物科技股份有限公司）；智能型恒温鼓风干燥箱（CMD-20X型，上海琅轩试验设备有限公司）；玻璃仪器气流烘干器（TH48SYBQ-1型，北京中兴伟业仪器有限公司）。

2.实验方法

黄芩样品的制备

    将黄芩在烘箱中60℃干燥8h，干燥后的黄芩用粉碎机粉碎成粉末，用分样筛（40目）筛分黄芩粉末，保证粉末均匀一致，密封保存，待用。

3. 总黄酮的测定方法

 芦丁标准曲线的绘制

    准确称取干燥至恒重的芦丁4.0mg 于小烧杯中，用50%乙醇溶解，并定容于25ml的容量瓶，摇匀，得浓度0.16mg/ml的标准液。准确吸取标准应用液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml 于6 个10ml容量瓶中，与上述容量瓶中分别加入5% NaNO20.3ml，摇匀，放置6min后，分别加入10% Al(NO3)3 溶液0.3ml，摇匀，放置6min后，再分别加入4% NaOH 溶液4ml，加50%乙醇定容至10ml，摇匀，以试剂空白为参比，放置10～15min，用紫外可见分光光度计进行全波长扫描，在最大吸收波长510nm处测定吸光度，得到吸光度Y与芦丁浓度X(mg/ml)间标准曲线回归方程。

4.提取液总黄酮含量的测定 

准确称取1.00g黄芩粉末，在不同的提取条件下提取黄芩总黄酮，提取液用乙醇稀释定容至50ml。准确吸取提取液1.0ml于25ml容量瓶，按上述方法显色后测定吸光度，代入标准曲线回归方程中可以得到黄芩中黄酮类物质的含量（mg/ml），从而计算出黄芩中黄酮类物质的提取率，即：

黄芩中黄酮类物质的提取率= ×100%

5. 单因素试验

    主要研究料液比、乙醇浓度、超声波时间、超声波温度4个因素，在保持其他因素相同的条件下分别进行单因素试验，研究各因素对黄芩总黄酮提取效果的影响，筛选最佳的提取条件。

    准确称取黄芩粉末，在不同的条件下进行超声提取，提取液冷却后用乙醇定容，按照2.2.2的测定方法，计算黄芩中总黄酮的含量。

6.正交试验

在单因素试验基础上，选择料液比、乙醇浓度、超声时间、超声温度4因素，设计L9（34）正交试验，以总黄酮的含量为评价指标，确定黄芩总黄酮超声辅助法的最佳提取工艺。

7. 总黄酮体外抗氧化性的研究

 对羟自由基清除作用的研究

原理：通过反应所产生的羟基自由基可将Fe2+氧化为Fe3+, Fe2+和邻二氮菲反应可产生有色络合物,向有色沉淀加入抗氧化剂后,其反应效果会相对减弱。羟基自由基对二价铁离子的氧化作用,会导致吸光值不断变化,从而评价样液消除羟基自由基的能力。

步骤:取0.75 mmoL/L邻二氮菲溶液1 mL,加入不同浓度的样液，再加0.75 mmoL/L硫酸亚铁1 mL混匀,加0.75mmol/l的过氧化氢1 mL,于37 ℃ 水浴下，水浴60 min后，在536 nm处测其吸光度,所得吸光度Ab。

    反应方程式：H2O2 + Fe2+=OH- +·OH + Fe3+ 

清除率S(%)=「Ax- Ab]/[As- Ab] ×100%

    其中 Ab：标准体系的吸光度

        Ax：不含黄芩提取液的吸光度

As：不含过氧化氢的标准体系

 对超氧自由基清除作用的研究 

原理：在碱性条件下，邻苯三酚能迅速发生自氧化反应，生成超氧阴离子自由和有色中间产物，且邻苯三酚自氧化速率与生成超氧阴离子自由基的浓度呈正相关，该有色中间产物在300nm处有一特征吸收峰。当加入抗氧化剂能催化超氧阴离子自由基与H+结合生成O2和H2O2 ,从而阻止了中间有色产物积累，溶液在320nm 处的吸收减弱。因此可通过测定添加试样前后吸光度A的变化来表示抗氧化剂对超氧阴离子自由基的清除效果。

步骤：取0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液（pH =8.2）4.5mL，置于25℃水浴中预热20min，分别加入0.1mL试样和0.4mL2.5mmol/L邻苯三酚溶液，混匀后于25℃水浴中反应4min，加入8mol/L HCl溶液两滴终止反应，于波长299nm处测定吸光度As，空白对照组以相同体积的蒸馏水代替样品,并计算清除率。

          清除率计算公式： S(%)=[(1-(As-A0 )/Ab]×100%

其中 Ab：不含黄芩提取物的标准体系吸光度

    As：标准体系的吸光度值

    Ao：不含邻苯三酚的标准体系吸光度

对DPPH自由基清除作用的研究

    原理：DPPH 在有机溶液中是一种稳定的自由基，其乙醇溶液呈深紫色，当 DPPH 溶液中加入自由基清除剂时，其孤对电子被配对，溶液颜色变浅，可由此来检测自由基的清楚状况，从而评价物质的抗氧化能力。

步骤：将样品储备液适当稀释得到不同浓度的黄芩黄酮溶液。 向一系列 10 mL比色管中加入 3.5 mL 1.0×10-4mol/L  的 DPPH 溶液和 0.5 mL 样品液，摇匀避光反应30 min，与波长517 nm下测定吸光度 A s。空白对照组以无水乙醇代替样品，并计算清除率。

清除率计算公式： 清除率S(%)=[(1-(As-A0 )/Ab]×100%

      其中 Ab：不含黄芩提取物的标准体系吸光度

            As：标准体系的吸光度值

            A0：不含DPPH的标准体系吸光度

8.结果与分析      

 芦丁标准曲线

由图可得，芦丁在0.02—0.10mg/ml浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系，R2= 0.9998。回归方程为Y= 11.47X+ 0.0554 

　　 通过单因素实验，得出各个单因素的最佳条件，其中料液比为1:10，乙醇浓度为50%，超声时间为20min，超声温度为40℃，为正交试验奠定了基础。然后用设计正交试验，确定了超声辅助法提取黄芩总黄酮的最佳工艺条件：乙醇浓度为50%、超声时间为25min、料液比为1∶10、超声温度为30℃。黄芩总黄酮的提取率为3.25%。

2.本实验分别就黄芩提取物对羟基自由基，超氧阴离子自由基和DPPH自由基的抗氧化性进行了测定，并与VC进行了对比实验，得到如下结论：在0.0025—0.0125mg/ml浓度下，提取物对各自由基清除能力为：DPPH > O2-•> •OH ，同浓度黄芩提取物清除能力普遍高于VC溶液，黄芩黄酮提取液和VC溶液对自由基清除率随其浓度的增大而增大。在浓度为0.0125mg/ml下，对羟基自由基的清除率为88.30%，对超氧基自由基的清除率为90.01%，对DPPH自由基的清除率为93.87%，由此可知黄芩总黄酮是一种天然有效的自由基清除剂。

黄芩中黄酮类化合物的利用已经有一定的规模，但黄芩中黄酮化合物的提取方法和工艺尚未成熟，所以充分利用黄芩资源是我国药用研究的科学发展方向。基于提取率、成本等因素的影响，通过对各种因素的比较分析，从而探索开发出适合工业化生产应用的方案，提高黄芩利用率，仍是研究工作的重点之一。

随着人们对健康的日渐重视，因黄芩中的黄酮化合物有着极高的药用营养及良好的保健作用，具有极为广阔的市场前景。本文旨在研究黄芩中黄酮类物质的提取工艺及其体外抗氧化活性，为黄芩中黄酮类化合物作为天然抗氧化剂和功能性药品得到开发利用提供理论基础。

四．总结：

黄芩富含黄芩苷，黄芩素等多种有效化合成分。具有抗氧化，抗菌，抗病毒，清热利尿，保肝降压等多种临床效果。我国多年来对黄芩的利用，主要是将黄芩简单处理，以切片形式作中药制剂利用，或将黄芩直接与其它中草药配伍利用。这种使用方法不能充分发挥黄芩的药用价值，造成资源的浪费。中药现代化的重要内容之一是中药生产过程中提取浓缩，分离纯化日渐受到学术界和应用界的关注。如何从黄芩中将有效成分充分提取出来，如何提高提取率和含量是研究和学习的关键。现代科技的不断进步，促进了黄芩中黄酮类化合物提取工艺和测量技术的发展，现在已经有很多种提取和测量方法，相信通过一代又一代的潜心努力，人们会越来越注重多种技术的联合应用，必将向着更科学，易操作，低成本，低污染，高效能的方向发展。