红景天胶囊中红景天苷含量的测定(三)

红景天胶囊中红景天苷含量的测定

1、超声提取时间确定：

分别以超声处理5，10，15 min提取同一样品，计算峰面积与取样量的比值。结果表明，超声处理10 min 与15 min，提取效果无差异，而与超声处理5 min 提取效果差异显著，故选择以超声处理10 min。

2、离心的作用：

大部分文献中前处理没有用到离心机，如：李慧侠. 《RＰ － HＰLＣ 法测定大花红景天和长鞭红景天中红景天苷的含量》[李慧侠. RＰ － HＰLＣ 法测定大花红景天和长鞭红景天中红景天苷的含量[J]. 中国药房杂志，2011，22（43）：4 098 － 4 099]’  ；方丽波，李成网，张洁《 HＰLＣ 法测定复方红景天胶囊中红景天苷的含量》[ 方丽波，李成网，张洁. HＰLＣ 法测定复方红景天胶囊中红景天苷的含量[J]. 安徽医药，2011，15（3）：310 － 311.]。本实验却显示，不离心机时有少数浑浊难以消除，离心后分离效果更好。

3、萃取试剂的选择：

分别用丙酮、甲醇和乙腈做萃取试剂，发现丙酮的萃取效果较差，乙腈比甲醇稍好。考虑到乙腈的价格是甲醇的四倍，固考虑用甲醇分两次萃取，其效果亦相当不错。

4、色谱柱的选择：

2015版中国药典使用的是C18柱，[ 中国药典2015版第一部254页 ]并未写明具体的细节。根据流动相中水相比较多的特点，使用亲水柱能取得更好的效果，同时延长色谱柱的使用寿命。另外使用核壳柱在保证分离效果的同时，能节省大约一半的时间，故本实验中使用核壳柱，使主峰的保留时间由10分钟左右[ 黄 萍 ，廖 建 ，刘仲义. 红景天胶囊中红景天苷的含量测定[J]中国药业2016.25(2).66-67]提高到5分钟左右。

5、流动相的选择：

大部分文献中采用甲醇：水做流动相，而本实验表明在流动相中加入适量的乙腈缩短柱的平衡时间，改善基线漂移。

6、波长的选择：

有文献用红景天苷的最大吸收波长215nm来做实验[ 李慧侠. RＰ － HＰLＣ 法测定大花红景天和长鞭红景天中红景天苷的含量[J]. 中国药房杂志，2011，22（43）：4 098 － 4 099.]，在本实验中215nm波长处杂峰的波长，综合权衡后采用275nm来测定。

四、注意事项：

由于液相色谱仪是高精密度的微量分析仪器，从前处理到仪器操作的每一个细节都有可能导致实验数据的偏差，甚至是实验的失败，所以部分细节需要特别注意：

1.流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。

2.样品进入仪器前需要用0.22um的滤膜过滤。

3.由于流动相在管路中高速流动，容易产生静电，所以跟其他仪器相比，高效液相色谱仪要求有更严格的接地。否则由于静电的释放会产生鬼峰，甚至损坏检测器。

4.过滤材料分为有机相和水相。使用时要注意辨别，否则会严重影响实验结

5.流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。    

6.不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。 

7.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然 后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上，以充分洗去离子。对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。 

8.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。 

9.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。      

10.C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。 

11.堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查并清洗。清洗方法；①以异丙醇作溶剂冲洗：②放在异丙醇中间用超声波清洗；⑧用10％稀硝酸清洗。 

12.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。 

13.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。      

14.要注意柱子的pH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。 

15.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。

16.样品进入仪器前需要用0.22um的滤膜过滤。

17.过滤材料分为有机相和水相。使用时要注意辨别，否则会严重影响实验结果。

五、结论：

   从实验结果看，用国产厂家高效液相色谱仪的测试结果完全符合实验要求，方法学考察结果与文献报道的用进口设备做的实验数据相当，如陶贵荣，赵银萍，齐建江等. 《不同地区红景天植物红景天苷含量比较研究》[ 陶贵荣，赵银萍，齐建江，等. 不同地区红景天植物红景天苷含量比较研究[J]. 西北植物学报，2010，30（9）：1 902 －1 905.]。浙江省医学科学院王巧懿 ，朱染枫《保健品中红景天甙含量测定及其稳定性研究》。天津市宝坻区药品检验所王海风《红景天苷的提取及含量测定方法概述等。而国产产品的价格不到进口产品的一半。比如一套二元高压梯度+自动进样器+紫外检测器，Waters在三十几万，安捷伦科技在三十万，赛智科技（杭州）有限公司的在十四万左右，上海伍丰在十三万左右。维护和维修的成本也远低于进口设备。比如Waters工程师的上门费用是400元每小时，日本岛津工程师的上门费用是300元每小时左右。进口厂家工程师的上门费用从工程师出发开始计时，上门的基本费用1500元以上。国产色谱厂家的上门服务费用则是以天计算，通常在500至800元每天。就服务费用来说，国产设备厂家的费用更是远低于进口设备厂家。而且服务态度比进口厂家工程师更好。部分进口仪器厂家面对客户时又居高临下的感觉，动辄职责客户没水平，不懂行。甚至把设备本身的问题推给使用者。正是由于进口产品价格昂贵，服务更贵，所以很多中小企业没有用上HPLC，部分企业虽然购买了进口HPLC，也很少使用，基本是“供奉”在实验室。这种现象不仅在企业存在，甚至在高等院校也普遍存在。很多高校毕业生虽然在学校里有仪器分析的课程，但毕业后在实际工作站对色谱类仪器敬而远之，不敢靠近，不敢使用。究其原因，是在学校上课的时候，只是老师在演示，一大堆人围着仪器看，部分人甚至不道老师在干什么，在使用什么仪器。如果购买国产高效液相色谱仪，使用和维护成本都大大降低，相信很多原来对HPLC可望不可及的企业会用上HPLC，原来在学校里没有机会使用仪器的学生也会有更多的机会来使用仪器。

综上所述，进过几十年的发展，在红景天苷含量的测试这个领域，我国自己生产的高效液相色谱仪所得到的实验数据跟进口高效液相色谱仪相当，能满足质量控制的要求。新仪器的购买价格不到进口仪器的一半，服务成本远低于进口厂商，这对节省企业（事业）单位成本，提高效益，保证产品质量有重大意义；对高校学生实际动手能力的提升也都有意义重大。

参考文献