葛根及其制剂中黄酮类化合物的HPLC测定方法概述(二)

1.葛根素纳米制剂

Luo 等 ［1］ 以单硬脂酸甘油酯、磷脂和泊洛沙姆 188 为载体材料制备了包载葛根素的固体脂质纳米粒，并利用快速分离液相色谱 － 串联质谱法检测了大鼠灌胃给药后在血液与尿液中葛根素的代谢产物，结果表明包载葛根素的固体脂质纳米粒与葛根素混悬液口服后的代谢产物相同，均为 4' － O － 葡(萄)糖苷酸葛根素与 7 － O － 葡(萄)糖苷酸葛根素，该结果提示葛根素包封于固体脂质纳米粒口服并没有改变葛根素体内的代谢途径或葡萄苷酸化的代谢产物。

提高葛根素对中风的治疗效果，Zhao等制备了包载葛根素的吐温 80 包覆聚氰基丙烯酸丁酯(PBCA)纳米粒，并评价了其对大脑局部缺血/再灌注损伤的作用。利用阴离子聚合法制备的 PBCA 纳米粒粒径 201. 2nm，Zeta 电位 － 7． 72 mV，体外释放实验表明其具有先快速释放后缓慢释放的双相动力学特征。小鼠组织分布实验表明纳米粒静脉给药后在脑部的药物浓度显著高于市售注射剂。给局灶性脑缺血损伤大鼠静脉给药，葛根素 PBCA 纳米粒通过显著降低神经功能缺损、提高体重、降低脑部含水量、减少梗死体积等作用呈现出良好的神经保护作用。这些结果表明 PBCA 纳米粒可有效提高葛根素对脑部的转运。

2.葛根素常用缓释制剂

崔京浩等根据胃内滞留剂的释药原理，将葛根素制成胃内滞留剂。首先将难溶物葛根素制成 H P－β－CD 包合物，作为滞留剂的内容物。以海藻酸钙做为滞留微丸的主要材料，通过考察其他辅料（甲基纤维素、硬脂酸镁、壳聚糖）对药物释放的影响。实验结果表明，硬脂酸镁为 2％时，滞留剂的漂浮效果最好。与此同时，考察该剂型在人工胃液中的释放情况，其在 8h 内的累积释放率为 87％，未出现药物突释现象。胃内滞留丸不仅表现了较好的漂浮效果，其缓释效果也很稳定。

宋金春等采用环糊精包合法，利用冷冻干燥法制备葛根素羟丙基－β－环糊精（H PCD）包合物。通过实验证实，葛根素环糊精包合物的溶解度是原料药溶解度的 20-30 倍，因此其包合物更适合制成脂质体。该实验采用大豆卵磷脂和胆固醇（1：2）作为药物载体，采取薄膜分散－冻融法将葛根素－β－环糊精（H PCD）包合物制成脂质体。将葛根素环糊精包合物脂质体的体外释放方程与 H iguchi方程拟合，r值为 0.983。由此可见。该种剂型具有较稳定的缓控释效果。

四、说明如何用HPLC法测定含葛根制剂中的黄酮化合物

1.HPLC法对黄芪葛根汤中的异黄酮类有效成分含量测定

刘火安究以葛根素和葛根总黄酮为指标，采用正交设计实验，重点对提取工艺进行系统综合评价，并对试验结果进行统计分析，最后确定最佳工艺条件是加9倍量3000乙醇提取3次，每次1h。提高了原料的利用率(提取率)，提取的黄酮比较完全，有利于指纹图谱的研究，也大大降低了成本。通过对影响大孔树脂吸附及解吸的各种因素系统研究，最后确定了大孔树脂分离葛根总黄酮的最佳工艺为树脂型号为日本三菱公司的SP70型大孔树脂，药液浓度为0.5g/mL(相当于原生药)，药液pH为5-6，吸附速率为2BV/h时吸附效果最好，上柱量为60倍树脂床体积。洗脱最佳工艺为5倍树脂床体积的70o。乙醇以2BV/h的速率洗脱效果最佳。经SP 70处理后的葛根总黄酮可达80%。以上，这种料液或做成的浸膏可应用于生产实际。该研究并筛选得到的大孔树脂SP70对葛根总黄酮进行分离纯化，明显优于AB-8。在葛根指纹图研究中，主要以葛根中的活性组分异黄酮作为指纹谱图研究的重点。从5种野葛药材的特征指纹峰图谱)都能找到了15个共有峰相对保留时间符合程度较好。其含量均大于90o，它们的特征指纹曲线重合度高。但相对峰面积相差较大，说明葛根用药应在固定产地的前提下，才能保证药品的一致性，因此建议有条件的制药企业可采用浸膏来控制生产工艺，保证药品的质量。

该研究通过对黄茂指纹图谱研究的方法进行了稳定性、精密度和重复性考察，建立了黄茂药材HPLC指纹图谱，并以参照峰进行相对保留时间和相对峰面积的考察;最后，建立对照指纹图谱，以参照物峰的保留时间和峰面积分别计算共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，不同批次黄芪的相对保留时间RSD小于l.0do。，而相对峰面积的RSD较大。由此可知，本实验建立的色谱方法可以使不同批次黄芪药材具有基本一致的色谱行为，但药材之间各种化学成分(活性组分)的含量受多种因素的影响具有较大差异。

2. HPLC同时测定不同产地葛根中6种主要异黄酮类成分的含量

肖学凤,高岚应用HPLC法测定安徽、山东、山西、湖北五个地方的葛根中异黄酮类成分的含量。广西以中国药典2000年版一部为理论基础,测定方法以甲醇-水(25∶ 75)为流动相,其异黄酮类成分的吸收峰与随后的小峰的分离度为1.2左右。他们在水中加入0.5%的醋酸,甲醇-水比例调到27∶ 73后,提高了两峰的分离度(大于2),故选用为流动相。根据药材的常用提取方法,考察了索氏提取与超声提取方法,并采用不同溶剂和提取时间进行综合考察,结果表明:以75%乙醇超声处理60 min的提取方法为最佳条件。取葛根药材适量,粉碎成粗粉,精密称取0.5 g左右,加至100 mL磨口锥形瓶中,准确加入75%乙醇50 mL称重,超声提取1h,放置室温,擦干锥形瓶并称重,补足溶剂减失的重量,摇匀,滤过,弃去初滤液,精密量取续滤液5mL至10 mL容量瓶中,加75%乙醇至刻度,摇匀,微孔滤膜(0.45μm)滤过,作为供试品溶液。研究发现粉葛中含异黄酮类成分不得少于0.30%。在5种产地葛根中以山东葛根含异黄酮类成分为最多。

刘喜舞、戴玲、叶惠煊等建立HPLC法同时测定中国、泰国葛根中异黄酮大豆苷、大豆苷元和染料木素的含量,为其质量控制提供方法学参考。方法:色谱柱为AT.LICHROM ODS-C_(18)柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相为甲醇和水,梯度洗脱;流速:0.8 ml·min~(-1);检测波长250 nm;柱温为25℃。结果发现大豆苷、大豆苷元和染料木素分别在0.15～0.88μg,0.10～0.63μg,0.15～0.89μg范围内呈良好线性关系,r分别为0.999 7,0.999 5,0.999 6。其平均回收率在99.5%～100.4%范围内,RSD均小于3%。结论:建立的方法简单、准确,分离效果好,首次用于中国、泰国葛根的定量分析和比较分析,为葛根的资源研究提供参考。

五、总结

传统中医药理论及现代临床研究表明，葛根具有良好的双向调节作用，特别是在补益方面功用确实很多，且药源丰富，价廉用广，可供药用及食用；可利用电子等排原理对其结构进行修饰，以改善水溶性和脂溶性，增强其药理活性。加强对葛根的研究，开发各种制剂和保健食品具有较好的医疗效益和社会效益。

参考文献

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