山楂中黄酮类化合物的测定方法概述 (10)(二)

山楂中黄酮类化合物的测定方法概述 (10)(二) 山楂中黄酮类化合物的测定方法概述

表1 TOF-MS筛查分析结果

tR /（min）离子（m/z）

[M+H]+ [M–H]– 可能

分子式环加双键数鉴定化合物

1 11.34 355.0872 352.0690 C16H18O9 8 *绿原酸

2 12.37 741.1567 739.1411 C39H32O15 24 己糖苷

原花青素B2[7]

3 13.97 579.1104 577.0969 C30H26O12 18 *原花青素B2

4 16.06 291.0679 289.0543 C15H14O6 9 *表儿茶素

5 17.90 867.2136 865.1492 C45H38O18 27 原花青素三聚体[7]

6 19.44 1155.2306 1153.2240 C60H50O24 36 原花青素四聚体[8]

7 24.39 465.0805 463.0623 C21H20O12 12 *金丝桃苷

8 25.01 465.0796 463.0719 C21H20O12 12 *异槲皮苷

图2(a)是原花青素四聚体的负模式质谱图。图中m/z 1153.2240为原花青素四聚体的分子离子峰，m/z 865.1697为四聚体丢失一分子表儿茶素单体的碎片峰，m/z 911.1759为865.1697结合一分子甲酸，结合文献[8]及紫外吸收光谱，判断该化合物为原花青素四聚体。

图2（b）为金丝桃苷的正模式质谱图。图中m/z 465.0799为金丝桃苷分子离子峰，m/z 487.0540为加钠峰，m/z 303.0372为分子离子分峰丢失一分子葡萄糖苷元的碎片离子，进一步通过与金丝桃苷对照品保留时间对比，确认该化合物为金丝桃苷。

图2 原花青素四聚体(ES-)(图a)及金丝桃苷(ES+) (图b)质谱图

2.5种黄酮成分定量方法的建立方法及测定结果

①样品的提取方法：

称取20.0 mg山楂粉末样品于1 mL容量瓶内，体积分数70%的甲醇定容，超声提取1小时，过0.45 μm微孔滤膜，得供试液

②对照品溶液的配制及线性关系的考察：

分别精密称取一定量的对照品，置5 mL容量瓶中，70%甲醇溶液溶解并稀释至刻度，作为混合对照品储备液，其浓度分别为绿原酸178.5μg·mL-1、原花青素B2 284.8μg·mL-1、表儿茶素 270.6μg·mL-1 、金丝桃苷150.0μg·mL-1 、异槲皮苷150.0μg·mL-1。

精密移取对照品溶液1 mL，逐级稀释，得不同浓度的对照品溶液，按上述色谱条件，分别进样10 μL。

③精密度实验:

按2.2.1及2.1.2项下供试品制备及液相色谱方法测定，重复进样6次。结果见表2，5个黄酮化合物的RSD均小于2.0%，表明精密度良好

④稳定性实验:

取2.2.3项下同一样品分别于0、1.5、3、4.5、6、7.5、12、24h后按2.1.2项液相色谱条件进样，记录峰面积，结果表明，24h内绿原酸、原花青素B2、表儿茶素、金丝桃苷、异槲皮苷的RSD均小于4.0%，表明供试品溶液有较好的稳定性。

⑤重复性实验:

精密称取山楂粉末6份，按2.2.1及2.1.2项下供试品制备及液相色谱方法测定，计算含量，结果见表2。5种黄酮的RSD均小于5.0%，表明方法重复性良好。

表2 方法学验证数据

线性方程

(r2=0.999) 线性范围

(μg·mL-1) 精密度RSD% 稳定性

RSD% 重复性

RSD%

绿原酸 y=10.66x+4.89 1.8~178.5 0.7 0.8 2.8

原花青素B2 y=6.42x-19.54 2.2~284.8 0.6 3.7 2.0

表儿茶素 y=5.33x+10.01 2.7~270.6 1.5 2.4 2.8

金丝桃苷 y=23.30x+7.67 1.5~150.0 1.6 1.7 4.3

异槲皮苷 y=23.07x+8.01 1.5~150.0 0.7 1.2 3.1

⑥加样回收率实验:

分别称取上述山楂样品9份，置容量瓶中，按80%、100%、120%的水平加入绿原酸、原花青素B2、表儿茶素、金丝桃苷、异槲皮苷对照品，每个水平平行三次，以70%甲醇定容至1 mL，按上述方法制备供试液，测定，计算回收率。结果见表3。

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