葛根及其制剂中黄酮类化合物的HPLC测定方法概述(二)

高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。

1．液固色谱法

使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5~10μm。适用于分离分子量200~1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。

2．离子对色谱法

又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。离子对色谱法常用ODS柱（即C18），流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/L的离子对试剂，在一定的pH值范围内进行分离。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离子强度有关。

3.高效液相色谱法的特点

①高压：液相色谱法以液体为流动相(称为载液)，液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～350×105Pa。

②高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于 1h 。

③高效：HPLC的分离效率高于普通液相色谱，在发展过程中又出现了许多新型固定相，使分离效率大大提高。

④高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般微升。

⑤适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大(大于 400 以上)的有机物(这些物质几乎占有机物总数的 75% ～ 80% )原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。 据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。

三、葛根及其制剂中黄酮类化合物的HPLC测定实例

(一)、葛根提取物中总黄酮含量的测定

1、材料和仪器

葛根提取物A，10克，购于陕西西安天然粉厂，葛根产于上海虹桥饮片厂；葛根素标准品，购于北京生化制品研究所。

主要仪器：TU-1901型双光束紫外可见分光光度计；TFUltiMate 3000高效液相色谱仪（配有UV检测器和chromeleon色谱工作站），分析天平；超声波清洗器。

主要试剂：1.0 mg/mL葛根素标准储备液（体积比为30/70的乙醇水做溶剂）；葛根提取物A；甲醇（色谱纯）；无水乙醇（分析纯）；超纯水

2、总黄酮含量的测定

①精密量取0.20、0.40、0.60、0.80和1.00 mL的葛根素标准储备液至于100 mL容量瓶中，用30%的乙醇水溶液稀释至刻度，摇匀。

②精密称取10 mg葛根提取物A，将其转移至50 mL的容量瓶中，用30%的乙醇水溶液稀释至刻度，摇匀，之后再精密量取0.50 mL溶液至于10 mL容量瓶中，用30%的乙醇水溶液稀释至刻度，摇匀，以上步骤平行三次。

③用紫外分光光度计扫描葛根素标准样品溶液的吸收曲线（浓度可随机选取），确定最大吸收波长，然后采用定量测量的方式，测定系列标准溶液的吸光度，绘制标准曲线。

④测定步骤②中葛根提取物A最终稀释样品的吸光度，取平均值，再对比标准曲线图，得出相应的浓度，最后分别计算两种葛根提取物中总黄酮的含量。

3、结果分析

大多数黄酮类化合物分子中存在桂皮酰基和苯甲酰基组成的交叉共轭体系，其在200～400 nm波长的区域内存在两个紫外吸收带，即位于带Ⅰ(300～400 nm)和带Ⅱ(240～280 nm)。其中带Ⅱ的吸收峰较强，是定量分析的重要依据，可采用紫外分光光度法测定样品中总黄酮类化合物的含量。由于葛根素是葛根中含量较多且具有代表性的一种黄酮，因而常以其为参考标准来测定葛根及其附加产品中总黄酮的含量。

(二)、羌黄颈康丸中的葛根素含量