含黄芪制剂中皂苷类化合物的HPLC测定方法概述 (3)

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一、皂苷类成分

二、黄芪中药概述

三、含黄芪制剂中皂苷类化合物的HPLC测定方法

一、皂苷类成分

（一）皂苷概述

皂苷是苷元为三萜或螺旋甾醇类化合物的一类糖苷。苷元为三萜类化合物则称为三萜皂苷，如为螺旋甾烷类化合物则称为甾烷皂苷。皂苷根据苷元连接糖链数目的不同，可分为单糖链皂苷，双糖链皂苷及三糖链皂苷。在一些皂苷的糖链上，还通过酯键连有其他基团。 

    在皂苷的化学结构中，由于苷元具有不同程度的亲脂性，糖链具有较强的亲水性，使皂苷成为一种表面活性剂，用力振荡其水液可产生持久性的泡沫。此外，一些皂苷对细胞膜具有破坏作用，表现出毒鱼、灭螺、溶血、杀精及细胞毒等活性。皂苷的表面活性作用受其连接糖链数日的影响，一般单糖链皂昔的溶血，灭螺作用更强，双糖链皂苷的作用稍弱。 

可用一些颜色反应对皂苷进行初步鉴定，最常用的颜色反应为Liebermann-Burchard反应，其方法如下：在试管中将少量样品溶十乙酸酐，再沿试管壁加入浓硫酸，如两层液体交界面呈紫红色则为阳性反应。

（二）皂苷的存在形式和分布 

皂苷由皂苷元和糖、糖醛酸或其他有机酸所组成。组成皂苷的糖常见的有：葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖和其他戊糖类。根据苷元又可分为两大类：三萜类皂苷和类固醇类皂苷。三萜又可分为四环三萜和五环三萜，其中以五环三萜为常见。四环三萜型皂苷中以达玛烷型皂苷研究较多，且较深入；五环三萜型皂苷中作药用的以齐墩果烷型 皂苷研究最多。类固醇皂苷中又分为螺固醇型皂苷和呋喃固醇型皂苷，以螺固醇型皂苷生理活性为显著。

类固醇类皂苷主要存在于单子叶植物百合科的丝兰属和知母属，以及菝葜科、薯蓣科、龙食兰科等；双子叶植物中也有发现，如豆科、玄参科、茄科等。三萜皂苷在豆科、五加科、伞形花科、报春花科、葫芦科等植物中比较普遍。很多重要的中药如人参、三七、绞股蓝、柴胡、黄芪、远志、商陆、桔梗和知母等所含的皂苷成分均已得到系统的研究。

（三）皂苷的抗肿瘤活性及作用机制

1.抗肿瘤作用

许多皂苷具有抗肿瘤作用，但这往往与这些分子的细胞毒作用相混淆。最令人激动的是近年来报道的取自百合科的虎眼万年青胆固醇类皂苷及其同系物，它们在体外对人体细胞无毒性，而对恶性肿瘤细胞却具有极强的毒性，可达临床常用抗癌药物如丝裂霉素、表柔比星、顺铂、喜树碱和紫杉醇的100倍。有许多三萜皂苷具有抗肿瘤作用，如取自中药的土贝母为葫芦科，是一种具有新颖酯环结构的!:香树脂素皂苷。其他的如来自肥皂草、铁仔、长春藤、阖藤子（豆科）、白蜡槭（槭树科）、韭叶柴胡（伞形科）、镰扁豆（豆科）、腺毛唐松草（毛茛科）、绞股蓝（葫芦科）、紫藤（豆科）和大豆（豆科）等植物的三萜皂苷。还有许多具抗肿瘤和细胞毒作用的类固醇类皂苷，对一些肿瘤细胞的半数有效量值在1.0ug/ml水平，如从七叶一枝花（百合科）中得到的螺旋固醇烷皂苷Pb。其他的如取自埃及酸叶木（蒺藜科）、龙血树（龙舌兰科）、苦茄（茄科）、灰叶烟草（茄科）和挂兰（百合科）等植物的类固醇类皂苷。很多类固醇类生物碱皂苷也 具有细胞毒作用，如茄啶皂苷、茄啶、α-番茄素的ED50值在1.0ug/ml水平。许多从海洋生物中分离得到的皂苷也具有细胞毒和抗肿瘤作用，如海参毒素。

2. 细胞毒作用

肿瘤的一个重要特征是无限制的增殖，体内外研究证实许多中药可直接杀灭癌细胞，从而发挥抗肿瘤作用。皂苷类成分也具有明显的细胞毒作用。大豆皂苷可破坏 S180 肿瘤细胞超微结构，使其细胞膜微绒毛变粗短、 数量减少、 线粒体肿胀，以上均表明大豆皂苷对 S180 肿瘤细胞有直接杀伤作用。

3.诱导细胞凋亡

三七总皂苷有促进甲基硝基亚硝基胍转化的人胃黏膜上皮细胞凋亡的作用，这可能是三七治疗胃癌癌前病变的作用机制之一。人参总皂苷能诱导人白血病细胞株 K562 细胞凋亡，其机制可能与调控癌基因产物的表达有关。 Xiao 等在重楼皂苷Ⅰ作用于一组细胞系及卵巢癌裸鼠模型的研究中发现重楼皂苷Ⅰ通过线粒体途径促进细胞凋亡，抑制裸鼠卵巢癌移植瘤模型的肿瘤生长，体内外都显示了明显的抗肿瘤功效。

4.抑制肿瘤转移

大豆皂苷抑制 HT-1080 细胞中 MMP2 和 MMP9 mRNA 的表达，刺激 MMP2 组织抑制剂组织型金属蛋白酶抑制物 2 的分泌，体内外实验结果都显示大豆皂苷能够抑制肿瘤扩散，具有良好的防癌特性。桔梗皂苷（ changkil saponin，CKS）的水提物显著地抑制 HT-1080 肿瘤细胞的浸润和转移，主要的作用机理分为两个部分：一方面 CKS 直接抑制核因子-κB （ nuclear factorkappa B，NF-κB）的激活，或者通过活性氧的产生间接抑制 NF-κB 的活性；另一方面 CKS 通过NF-κB 信号通路，抑制 MMP2 和 MMP9 的激活，从而发挥其抗肿瘤效应。

二、黄芪中药概述

黄芪，始载于《神农本草经》，被列为上品，距今已有2000多年的历史。2010版中国药典规定来源于豆科科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(fisch.)Bge. var. mongholicus (Bge. ) Hsiao或膜夹黄芪Astragalus membranaceus(fisch.)Bge. 另外，还有一种红芪来源于豆科植物多序岩黄芪Hedysarum polybotrys hand.mazz 的干燥根。具有补气固表，利尿托毒，排脓，敛疮生肌的作用。主要用于气虚乏力，食少便溏，中气下陷，久泻脱肛，便血崩漏，表虚自汗，气虚水肿，痈疽难溃，久溃不敛，血虚萎黄，内热消渴；慢性肾炎蛋白尿，糖尿病。蜜制黄芪益气补中。用于气虚乏力食少便溏等症。

（一）抗氧化、抗衰老及免疫调节作用

1．抗氧化 

金若敏等通过口服给药，观察了黄芪毛 状根对D．半乳糖所致衰老小鼠记忆力的影响 及抗氧化作用；制备大鼠肾缺血再灌注模型， 测定黄芪毛状根对肾组织超氧化物歧化酶 (sOD)活性及丙二醛(加A)含量的影响；测定 环磷酰胺所致免疫功能低下小鼠口服黄芪毛 状根后NK细胞活性。结果表明，黄芪毛状根 能改善衰老小鼠记忆力，提高脑、肝组织SOD 活性并降低肝脏MDA含量，能降低缺血再灌 注大鼠肾MDA含量及血肌酐浓度，还能提高 免疫功能低下小鼠NK细胞活性。说明黄芪毛状根具有抗衰老、抗过氧化及免疫调节作 用。

2.抗衰老

人的衰老与年龄有关，而血清羟脯氨酸  (HoP)与年龄有密切关系。幼年骨骼正在  发育，胶原蛋白代谢率高，血清HO P含量高。  随着年龄增长，胶原蛋白代谢下降，血清HDP  含量下降。血清HO P含量的测定可作为衡量  胶原蛋白总代谢的指标因此血清HO P含  量可反映机体发育年龄，胶原蛋白可作为一个  生物年龄的客观指标。庄晓燕等将黄芪胶  囊给予45名健康老人连续服用3个月，分别  于服用前及服用后测定血清HO P含量。结果  显示，服用黄芪胶囊后血清HO P含量明显升  高(P<0．01)。研究表明：黄芪有加速胶原蛋  白转化率的作用，使生物年龄变得年轻，可延  缓衰老。抗衰老、抗过氧化及免疫调节作 用。

3.免疫调节作用  

对单核巨噬细胞的影响：黄芪注射液  腹腔给药，对正常小鼠和氢化泼尼松小鼠胸腺  有增量作用，并增加氢化泼尼松小鼠网状内皮  系统吞噬功能：增加环磷酰胺小鼠血清溶血素  抗体生成能力，增强正常及荷瘤小鼠淋巴细胞  转化能力。黄芪能恢复或提高烧伤小鼠腹  腔巨噬细胞(m@)明显抑制的吞噬活性及其降  低的酸性磷酸酶的含量。黄芪激活的n西对  日本血吸虫杀伤作用，显著优于正常—砷，说明  黄芪为良好的激活剂。

三、含黄芪制剂中皂苷类化合物的HPLC测定实例。

（1）复方黄芪口服液，由顾利青、汤道权测定。

　　方法:高效液相色谱法。采用YWG-C18柱,乙腈:水(1:2.3)为流动相,检测波长为203nm。结果:不同批号(三个批号)样品中 黄芪甲苷的含量分别为138μg/ml,177μg/ml,167μg/ml。结论:该方法简便,快速,灵敏适用于复方黄芪口服液的质量控制。

（2）复方黄芪注射液，由李永吉、管庆霞、关延彬、李秋红测定。

建立复方黄芪注射液中黄芪总皂苷与黄芪甲苷含量的测定方法.方法:黄芪总皂苷采用比色法(540nm,722型分光光度计);黄芪甲苷采用HPLC-ELSD法,Novapark( )C18(3.9*150mm,4μm)色谱柱,流动相为乙腈-水(36:64),流速为1ml/min,柱温30℃,ELSD参数:移管温度为105℃,气体流量1.50SLPM.结果:总皂苷平均回收率为100.64%,RSD为1.74%;黄芪甲苷平均回收率为99.62%,RSD为1.57%.结论:方法简便、快捷、准确、可靠,可用于复方黄芪注射液的质量控制。

（3）中药饮片黄芪，由阎汝南、王静竹、刘舒平、郭楠、关莹测定。

　　目的：测定不同产地黄芪中黄芪甲甙含量。方法：高效液相色谱法。采用ＹＷＧＣ１８柱，乙腈水（１∶２３）为流动相，检测波长为２０３ｎｍ。结果：不同产地黄芪中黄芪甲甙含量差异很大。该法平均回收率为９６１％，ＲＳＤ为２１５％（ｎ＝５）。结论：本法快速，简便，准确，适用于黄芪药材的质量控制。